皇冠上的珍珠|冷冻电镜结构揭示miRNA加工过程的重要识别机制

责编 | 酶美

真核细胞中存在着大量不能翻译成蛋白质的RNA，被称为非编码RNA。它们在有机体基因表达调控等诸多方面发挥重要作用，广泛参与生长发育、组织分化等生物学过程，并且与疾病的发生、发展密切相关【1】。

microRNA（miRNA）是一类非常重要的非编码RNA，长度约为21~24个碱基。它们通过碱基互配与靶标mRNA相结合，从而抑制蛋白质翻译，或促进mRNA降解【2】。1993年，研究者在线虫中发现了第一个miRNA【3】。在接下来的二十多年里，已有数以万计的miRNA被鉴定。它们在低等到高等生物中普遍存在并具有一定的进化保守性，其中一些已经被作为癌症等疾病的药物研发靶点及诊断指标【4】。因此，miRNA的功能及其自身的生成与调控机制一直都是研究热点。

在哺乳动物中，初始miRNA（pri-miRNA）伴随着基因组DNA转录而产生，其长度可达数千个碱基。其核心部分为一个茎环结构，功能miRNA包藏在该结构的茎部双链区。从pri-miRNA到成熟的功能miRNA需要依次经历发生在细胞核内与胞质中的两步切割反应，分别由III型RNA酶家族成员Drosha (核内)和Dicer（胞质）催化完成【2】。2018年，王宏伟课题组解析了Dicer复合物与底物的冷冻电镜结构，阐明了Dicer对miRNA的识别加工机制【5】(Cell丨清华王宏伟组揭示人源Dicer蛋白的工作机制——王艳丽、麻锦彪点评)。不同于Dicer识别底物的模式，Drosha发挥功能需要与DGCR8形成复合物（也被称为Microprocessor复合物），其中Drosha是核心催化组分，DGCR8为双链RNA结合蛋白，负责招募pri-miRNA底物。Drosha/DGCR8复合物早在2004年即被发现【6,7】，然而一直以来，受限于难以获得高表达及稳定均一的重组蛋白等因素，其结构生物学研究进展缓慢。尽管前期的体外功能研究积累了大量的数据，包括鉴定了pri-miRNA上的关键序列、筛选了蛋白质的功能结构域【8,9】等，但是并未解答这些序列究竟如何被识别、以及蛋白质功能域如何参与界定pri-miRNA切割位点这些重要科学问题。

2020年3月27日，Molecular Cell杂志在线刊发了两篇背靠背文章，解析了Microprocessor复合物和pri-miRNA结合，对其进行加工的结构。一篇来自中国科学院生物物理研究所许瑞明研究组、清华大学王宏伟课题组合作发表题为 Structural Basis For pri-miRNA Recognition by Drosha 的论文（第一作者金文星博士，王家博士）；一篇来自UT Southwestern Yunsun Nam课题组和Stanford University Wah Chiu课题组的合作论文，题目为：Cryo-EM structure of human Drosha and DGCR8 in complex with primary microRNA（第一作者Alexander C. Partin，张凯铭博士）。

在两项研究中，研究人员成功纯化、组装了人源Drosha/DGCR8，及其结合pri-miRNA的复合物。经过一系列条件优化，包括交联剂筛选、金属离子置换以稳定复合物结构，经过上千次电镜以摸索最合适条件，最后对之进行了结构解析。

第一篇来自中科院和清华大学合作研究成果，证实了Drosha在切割位点界定中的决定性作用，并首次明确了PAZ、MB helix、以及dsRBD结构域分别对pri-miRNA的相应区域进行识别，协同完成切割位点的定位（图1）。其中，PAZ结构域在RNA结合前后出现了明显的构象变化，它与MB helix一起，结合在pri-miRNA的双-单链交界区的两侧，形成三明治状稳定结构。这个现象一方面从机制上阐明了pri-miRNA双-单链交界区是决定切割位点的关键顺式元件的原因，另一方面提出了PAZ结构域识别RNA的新模式（此前报道的其他蛋白PAZ结构域仅仅识别RNA的3’末端）。

图1 Drosha通过PAZ、MB helix、dsRBD结构域识别pri-miRNA，结构域在结合底物前(左)后(右)发生构象变化

这项工作同时还发现了PAZ结构域的构象变化反映了Drosha的不同活性状态。在没有pri-miRNA结合时，PAZ的发卡状双螺旋占据了切割活性中心区域，从而阻碍了RNA的结合；当识别pri-miRNA底物时，该螺旋结构向下翻转并结合RNA，反而稳定了与底物的相互作用。研究人员认为，这是一种从自抑制状态到活化状态的转变，表明Drosha存在活性调控模式。由于体内存在很多miRNA类似物，这种可调控模式对于底物的特异性识别具有重要意义。

另一篇来自UT Southwestern和Stanford University的研究成果，阐明了Drosha和DGCR8的双链RNA结合域（dsRBD）形成了一个“分子标尺”，卡住了pri-miRNA的~35bp双链茎部结构，而DGCR8的HBR结构域则围绕在pri-miRNA顶环结构周围，这保证了Microprocessor对pri-miRNA的特异并灵敏识别。催化区域RIIIDa和RIIIDb均结合在茎部双链区。pri-miRNA的底部双链RNA-游离单链RNA由Drosha的螺旋带状结构域和锲形结构域围绕，对切割加工准确性至关重要。这项工作中研究人员解析了两个活性状态的结构，包括pri-miRNA部分结合 (partially docked state) 以及全结合 (fully docked state)，研究人员同样观察到，pri-miRNA底物从部分结合到全结合过程中，Drosha的helix belt结构域发生翻转，并与Drosha的C端、锲形、RNA结合域“四位一体”，如同为底物系好了“安全带”，保证了对底物的特异结合和稳定。

总结来说，Drosha和DGCR8通过多结构域协作，实现了对pri-miRNA的特异识别和精确加工。miRNA的核内加工过程得到完整的展现。这两项成果来自于研究人员数年坚忍长期的努力，最终克服技术瓶颈，才采撷了这颗“皇冠上的珍珠”！

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原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.02.024

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.02.024

制版人：珂

参考文献

1. Cech TR, and Steitz JA, The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell, 2014 157(1): p. 77-94.

2. He L and Hannon GJ, MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genet, 2004 5(7):522-31.

3. Lee RC 1, Feinbaum RL , Ambros V , The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993 75(5):843-54.

4. Gregory RI and Shiekhattar R, MicroRNA Biogenesis and Cancer. Cancer Res, 2005 65: 3509-3512.

5. Liu Z, Wang J, Cheng H, Ke X, Sun L, Zhang QC, Wang HW, Cryo-EM Structure of Human Dicer and Its Complexes with a Pre-miRNA Substrate. Cell, 2018 173(6):1549-1550.

6. Gregory RI, Yan KP, Amuthan G, Chendrimada T, Doratotaj B, Cooch N, Shiekhattar R, The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature, 2004 432: 235–40.

7. Denli AM, Tops BB, Plasterk RH, Ketting RF, Hannon GJ, Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature, 2004 432: 231–5.

8. Nguyen TA, Jo MH, Choi YG, Park J, Kwon SC, Hohng S, Kim VN, Woo JS, Functional Anatomy of the Human Microprocessor. Cell, 2015 161: 1374–1387

9. Kwon SC, Nguyen TA, Choi YG, Jo MH, Hohng S, Kim VN, Woo JS, Structure of Human DROSHA. Cell, 2016 164: 1–10